Transgen=
esis y clonacio=
n
en porcinos
Daniel F Salamone
Laboratorio Biotecnología Animal.
FA-Universidad de Buenos Aires, Argentina.
La transgénesis que significa la
introducción de ADN exógeno en el genotipo de un animal es una
herramienta importante tanto para la agricultura, como para la
farmacología, la biomedicina y
El principio básico de la clonaci&oac=
ute;n
por transplante o transferencia nuclear consiste en remover el núcle=
o de
un ovocito maduro no fertilizado (ovoplasto recipiente) y transferirle un
núcleo o una célula entera (núcleo o célula
donante).
Las células somáticas se repro=
ducen
in vitro con gran facilidad y como toda célula =
diploide
no reproductiva de un individuo tiene la misma información
genética, por lo que mediante el transplante nuclear teóricam=
ente
se pueden producir tantos animales idénticos como se deseen. Este gr=
upo
de animales idénticos se denomina clón
y el procedimiento para generarlos clonación.
La extracción del núcleo del o=
vocito
se realiza generalmente por micromanipulación y aspiración con
pipetas de vidrio, controladas por equipos de movimiento de precisión
denominados micromanipuladores. El núcleo del ovocito madurado in vi=
tro,
normalmente se detiene después de la primera división meiótica en el estadio de metafase II, hasta el
momento de ser fecundado por un espermatozoide. Después de la
fecundación será el espermatozoide mediante un proceso denomi=
nado
“activación” quien inicia una serie de sucesivas
duplicaciones del ADN y divisiones celulares. En la clonación la
activación debe ser realizada artificialmente por la aplicació=
;n
de diversos métodos químicos o físicos.
La tecnología básica para la
clonación por transplante nuclear en mamíferos fue desarrolla=
da
en el ratón en los años 80 usando como donante células=
de
embriones (blastómeros), pero los resultados en esta especie fueron
desalentadores. Sin embargo, Willadsen (1986), =
usando
como donante blastómeros de embriones tempranos produjo los primeros
corderos clonados. Un año después Robl
et al., (1987) con el mismo tipo de células donante produjeron los
primeros terneros clonados. El primer clon de cerdo obtenido a partir de
embriones de 4 células fue reportado en 1989 (P=
rather
et al.) pero no se pudieron
alcanzar resultados similares hasta 10 años después (L=
i et
al., 2000).
La técnica de clonado con célu=
las
embrionarias no logro tener gran aceptación a los entre investigador=
es y
profesionales debido a numerosos factores. Entre ellos el hecho que se
debía trabajar con células embrionarias cuyo mérito
genético era desconocido, además los embriones tempranos tien=
en
un reducido número de células. Sumando a esto las bajas tasas=
de
preñez y dificultades en el parto producidas por el excesivo peso de=
las
crías no se promovió la aplicación comercial de
Como inicialmente los resultados de
clonación con células donantes adultas eran poco eficientes, =
se
considero la posibilidad de usar células fetales como células
donantes. Los grupos del Instituto de Roslin
Los telómeros (la parte extrema de los
cromosomas) de la primera oveja clonada (Dolly) eran mas cortos y no
correspondían su edad real, sino con la edad de la célula don=
ante
(Ashwor=
th
et al., 1998). En otras palabras, sus telómeros eran los=
de
una oveja varios años más vieja qu=
e la
que correspondía a la edad de Dolly. Los telómeros se van
acortando cada vez que las células se dividen llegando hasta un
determinado tamaño, a partir del cual las células no se divid=
en
más. Normalmente este mecanismo protege al organismo de que se
multipliquen en exceso células potencialmente peligrosas. Sin embargo
investigadores de
Algunos de los grandes problemas de la
clonación, inicialmente descriptos en los trabajos de neozelandeses y
japoneses (Wells
et al., 1999; Kato et al., 1999), siguen siendo actuales, como son las numerosas
perdidas durante la preñez y la alta mortandad =
perinatal,
obligando ésta ultima a realizar cuidados intensivos en los
recién nacidos. La causa aparente de este problema, al menos en part=
e,
se debe a anomalías placentarias. Una de las hipótesis es que=
la
expresión de los genes de los animales clonados es incorrecta y que =
la
célula donante fue reprogramada ineficientemente por el ovocito
enucleado.
A continuación describimos algunos
experimentos que si bien los realizamos en bovinos, nos describen algunas de
las variables a considerar para la producción de animales clonados y
transgénicos en otras especies.
=
Experimento 1: Clonación de cé=
lulas
adultas y sistema de cultivo
En un primer experimento destinado a increme=
ntar
la tasa de supervivencia de los embriones clonados a partir de animales
adultos, comparamos diferentes sistemas de cultivo embrionario y diferentes
tipos de células somáticas donantes. El objetivo de este expe=
rimento
fue establecer las condiciones mas adecuadas para
producir embriones clonados, en paralelo, se realizaban experiencias de
transfección con células fetales.
Células de la granulosa y fibroblastos
provenientes de animales adultos fueron utilizadas como células dona=
ntes
al comparar diferentes sistemas de cultivo embrionario. Después del
transplante nuclear, fusión y activación, tres sistemas de
cultivo se utilizaron, cuando las células donantes fueron fibroblast=
os
adultos: TCM-199+5% FCS o Menezo+5% FCS (ambos =
con
células Vero como co-cultivo y
atmósfera con 5 % de CO2 en aire) y SOF sin co<=
/span>-cultivo
pero con una baja concentración de 5 %O2, 5% CO2, y 90 % de N2. Para=
las
células de la granulosa, los embriones producidos solo se cultivaron=
con
Menezo+5% FCS y células Vero como co-cultivo y 5 % de CO2 en aire.
Los resultados de este experimento se descri=
ben en
la tabla 1. El grupo tratamiento SOF obtuvo clivaje y
desarrollo hasta blastocisto en mayor proporción que los otros
tratamientos, además se simplifico el trabajo de laboratorio dado que
entre otras ventajas no se necesitaba preparar la línea celular para=
el co-cultivo, por lo que se decidió su
utilización en el siguiente experimento. Sin embargo el único
animal que llego a término fue producido a partir de TC199 + VERO, p=
ero
murió durante el parto.
Tabla 1. Experimento 1:
Clonación con células adultas
|
Tratamiento |
n |
Clivaje (%) |
Blastocito (%) |
Preg. (%) |
Nacimientos |
|
Granulosa C199+VERO |
92 |
|
26 (28)b |
11 (12) |
0 |
|
Fibroblasto TC199+VERO |
294 |
|
22 (7.5)a |
5 (38.4) |
1 |
|
Fibroblasto Menezo+VERO |
324 |
72.3 bc |
29 (8.9)a |
5 (29.4) |
0 |
|
Fibroblasto SOF |
108 |
75.0 bc |
24 (22.2)b |
5 (45.4) |
0 |
abc=
Porcentages dentro columnas con diferente letr=
as son
diferentes (P<0.05)
=
=
=
=
Experimento 2: Clonación de cé=
lulas
fetales transgénicas y ovoplasto tratados con roscovitina
En un segundo experimento se comparo el desa=
rrollo
de embriones bovinos producido de líneas fetales no transfectadas y
transfectadas, en este último grupo se utilizo ovoplastos tratados c=
on
roscovitina o no. Esta droga permite inhibir la maduración por un
periodo de 24 horas lo que favorece la posibilidad de ir un día al
matadero y trabajar 2 días diferentes. Nuestra hipótesis era
también que la roscovitina eventualmente puede mejorar la viabilidad=
del
embrión producido. La técnica utilizada con algunas
modificaciones fue descripta previamente (Salamone et al., 2001).
Los embriones producidos en los todos los
tratamientos fueron cultivados en SOF sin co-cu=
ltivo
pero con una atmósfera de 5% de O2, 5 % de CO2 y 90 % de N2. Se
utilizaron como célula donante fibroblastos fetales, transfectados
o no. Para la línea transfectada también se determino si la
roscovitina podía incrementar la disponibilidad de ovocitos recipien=
tes
a lo largo de la semana y o incrementar su viabilidad.
Los
resultados se describen en la tabla 2. No se observaron diferencias entre l=
os
tratamientos. La transfección no afecto la capacidad de desarrollo de
los animales clonados, tampoco afecto el tratamiento de la receptora con
roscovitina, sorprendentemente con este último tratamiento se observo
una tendencia positiva en el desarrollo. Se produjeron trece animales
transgénicos en menos de un año de trabajo lo que demuestra el
potencial de clonación en la transgénesis de animales de gran=
ja.
Tabla 2. Experimento 2:
Clonación utilizando como células donantes fibroblasto (F.)
fetales transgénicas y recipientes tratados con roscovina.
=
|
Tratamiento |
n |
Clivaje (%) |
Blastocito (%) |
Implantes |
Preñez |
Nacidos |
|
F. no t=
ransfectado |
197 |
122
(62) |
33
(16.7) |
16 |
5 (31) |
1 |
|
F. tran=
sfectado |
646 |
476
(74) |
128
(19.8) |
56 |
25
(44.6) |
7 |
|
F. tran=
sfectado
roscovitina |
228 |
191
(84) |
51
(22.3) |
30 |
16 (53.3) |
6 |
Utilizando células donantes adultas se
observo que un solo feto prospero hasta la fecha de parto a pesar de haber
producido numerosas preñeces (ver Tabla =
1).
Esto coincide con otros autor=
es (Wells et al., 1999; Kato =
et al.,
1999). Estos autores describe=
n alta
mortandad perinatal de los terneros producidos =
por
clonado, en nuestra experiencia el único animal producido muere en el
parto demostrando la necesidad de incrementar los cuidados intensivos del
recién nacidos.
A diferencia de otros autores la
transgénesis no indujo una reducción en la capacidad de
desarrollo de los embriones clonados (Forsberg =
et
al., 2002). En tanto que el tratamiento con roscovitina no solo no redujo la
viabilidad sino que permitió observar un tendencia positivo en el
desarrollo embrionario. La roscovitina es un inhibidor de MPF y MAPK, dos
complejos reguladores de la maduración ovocitar=
ia.
Después de iniciada la maduración normal todos los eventos son
regulados por un rápido incremento en MPF y MAPK citosólicos.
Los cuales previenen la reconstrucción de la membrana nuclear y la
entrada del núcleo en fase de síntesis de ADN hasta la
fertilización o activación. La maduración nuclear se p=
uede
detener con roscovitina dado que mantiene MPF y MAPK bajos. Esto permite
retrasar la maduración 24 horas. La combinación del uso o no =
uso
de esta droga posibilita trabajar por 2 días después de una s=
ola
visita al matadero. Si no se tratan los ovocitos con roscovitina 24 hs después se tendrán numerosas metafas=
es II
para enucleación y el transplante nuclear. Por el contrario, si son
tratadas con roscovitina recién podrá realizarse el transplan=
te
nuclear 48 hs después, dado que las prim=
eras
24 hs en roscovina =
inhiben
la maduración manteniendo el ovocito como vesícula germinal y
luego se requiere 24 horas mas para llegar a metafase II.
En la Argentina se han adoptado muchas de las
llamadas “Biotecnologías de la Reproducción” con
relativa rapidez, tanto por la acción de profesionales de la activid=
ad privada
como la realizada por investigadores de organismos oficiales. Prueba de est=
o es
la realización en 1978 de las primeras transferencias quirúrg=
icas
de embriones por el doctor Rodríguez Dubra y
colaboradores, los primeras nacimientos por fertilización in vitro
(Salamone et al. 1995), las preñeces (
El clonado ha tenido un progreso tan vertigi=
noso y
un interés general tan grande que ha sido fácil seguir su
evolución por los medios de divulgación masiva. Sin embargo, =
ha
prevalecido el enfoque alarmista debido a su potencial aplicación en
humanos. Por el contrario es nuestra opinión que esta técnica
ayudará a generar conocimientos básicos para descubrir las ba=
ses
de la totipotencialidad celular y la rediferenciación de los tejidos, permitiendo su
aplicación terapéutica, para regenerar tejidos lesionados,
incluyendo el tejido nervioso, y el pancreático entre otros.
=
Clonación y transgénesis en po=
rcinos
Después de la exitosa clonació=
n de
ovinos, bovinos y caprinos numerosos laboratorios intentaron clonar cerdos.=
A
pesar de los esfuerzos, en esta especie los resultados no fueron buenos
inicialmente. Esto motivo que numerosos grupos hayan continuado con la
producción de cerdos transgénicos por microinyección <=
span
class=3DSpellE>pronuclear. Así se han generado cerdos con un
incremento de la conversión alimenticia, originados por la
introducción de la construcción compuesta por metalotioneina
+ hormona del crecimiento (Nottle et al,.1999).
Recientemente también se han obtenido cerdos destinados a aumentar la
asimilación del fósforo y reducir la concentración de =
este
elemento en las heces, mediante la expresión de la fitasa
bacteriana en la glándula salivar de cerdos, esto tendría
beneficios al reducir la polución ambiental. La fitasa
es una enzima que desdobla el ácido fíti=
co
liberando el fósforo d=
el
mismo (Golovan et al., 2001). También se=
ha alterarado la leche de los cerdos para incrementar la=
salud
y el desarrollo de los lechones esto se ha logrado sob=
reexpresando
alfa-globulina bovina (Wheeler et al 2001). Est=
as
técnicas de modificación genética se realizaron en est=
os
trabajos basadas en la introducción del DNA foráneo por micro=
inyección
en
El primer cerdo producido por clonació=
;n de
células somáticas fue producido en el año 2000 (Polejaeva et al) desde esta fecha se han hecho import=
antes
progresos. Entre ellos la producción del los primeros cerdos por
incorporación de genes al azar (Park et =
al.,
2000; Lai et al., 2001 y 2002). Si bien esta
modificación aumenta la eficiencia en la obtención de animales
transgénicos, la
integración del transgen continúa siendo al azar, por lo cual=
la
expresión del mismo es esencialmente impredecible. Para soklucionar este problema hemos estado reclonando
los animales con expresión adecuada (Salamone et al., 2004) para ten=
er
animales de produccióm predecible, pero =
aun
son necesarias futuras mejoras.
La técnica de recombinación
homóloga permite la modificación precisa de los genes existen=
tes,
evita los problemas derivados de los efectos posiciónales y de inactivación por inserción y permite
además la inactivación de genes
específicos así como el reemplazo de un gen por otro. La
utilización de la técnica de recombinación homó=
loga
permite aplicaciones sumamente atractivas en el campo de la producció=
;n
animal (Piedrahita, 2000).
=
En cerdos la transgénesis en sitio
especifico o recombinación homologa ha sido lograda exitosamente (
Los cerdos son fisiológicamente simil=
ares a
humanos y ha habido intenso interés en utilizarlo para transplante de
órganos, así como, para modelo de enfermedades. La
producción de órganos y tejidos animales humanizados para ser
utilizados en transplante ha despertado también un interés
enorme. Esto implicará la expresión de ciertas proteín=
as
humanas y el silenciamiento de algunas proteínas de origen animal. E=
sto
puede lograrse creando cerdos por recombinación homologa mediante el
llamado “knockout de la alfa-1,3-galactosiltransferasa”. Para obtener producto p=
ara
transplante es probable que se requieran sucesivas modificaciones
genéticas.
La expresión de proteínas de v=
alor
biológico especialmente de interés farmacológico usando
como biorreactores animales transgénicos
a demostrado ser un sistema muy eficiente de producción en numerosas
especies. Las limitaciones han sido el nivel de expresión,
modificaciones post-transcripcionales y el efec=
to
biológico de la proteínas exógena=
s
sobre el animal que las produce. Una vez que el animal fundador ha sido
obtenido también es una limitante llegar a tener un buen numero de
animales a escala comercial. En el porcino se ha seleccionado las vesículas seminales como &o=
acute;rgano
de expresión de dichas moléculas. Las ventajas que tiene dich=
as
glándulas incluyen el hecho que el semen luego de producida la puber=
tad
es generado constantemente y por lo tanto también el fluido seminal,
además se puede colectar en una forma no invasi=
va,
no dolorosa y que no requiere gran entrenamiento. Un cerdo transgénico
puede producir por muchos años y ser reemplazado por reproducci&oacu=
te;n
simple en forma no muy costosa. El plasma seminal es una secreción
externa y una vez producida no es reabsorbida, es mas, el exceso de secreción
prostática es eliminada por uretra a través de
Los cerdos son una especie con una eficiencia
reproductiva importante, un macho heterocigoto puede inseminar unas 50 cerd=
as
por mes utilizando inseminación artificial y cada una de estas puede=
dar
origen a 10 lechones, 5 de los cuales serán machos y 2-3
transgénicos, originando un grupo de 150 lechones en 5 meses, por lo=
que
al año habría un numero suficiente de machos para empezar a
producir a escala industrial
A la
pregunta ¿cuales serán sus aplicaciones agropecuarias en nues=
tro
sistema de producción? La respuesta es que nuestra capacidad de
imaginación e innovación es insuficiente. La aplicación
más inmediata será la multiplicación de animales de el=
ite.
La utilización de animales clonados facilitara la producción y
difusión de animales transgénicos. Por ejemplo, existe
interés en Europa en reemplazar el gen PrP que
torna a los bovinos susceptibles al virus de la vaca loca por otro que le
otorgue mayor resistencia. Numerosas compañías ya han produci=
dos
animales transgénicos y clonados especialmente expresando nuevas
proteínas en leche de valor farmacéutico (Baguisi et al., 1999, Salamone et al. 2005). Hay proyectos que intentan producir cerdos
modificados genéticamente para producir semen de un solo sexo, o
utilizar cerdos como modelo para enfermedades humanas como la arteriosclero=
sis,
etc. (Forsberg, 2005). Todo es=
to indica
la enorme potencialidad de esta técnica y el futuro desarrollo que p=
ueda
alcanzar en la especie porcina.
A
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